Proboscidean Mitogenomics: Chronology and Mode of Elepahant Evolution Using Mastodon as Outgroup.

Oleh: Nandin Rohland, Ann-Sapfo Malaspinas, jushua L. Pollback, Montogomey Slatkin, Paul Matheus, Micheal Hofreiter

Resume Jurnal

ABSTRAC

Penulis melakuakan penelitian tentang mtDNA yang berasal dari fosil Mastodon (Mammuth americanum), fosil tersebut diperkirakan berumur 50.000-130.000 tahun yang lalu. Dengan menggunakan fosil Mastodon yang diperkiraan hasil dari evolusi . Penulis menggunakan DNA Sequence untuk dapat mengetahui asal dari Gajah Asia dan mammoths. Penulis juga membandingakan Sequence  Mastodon untuk mengetahui asal dari Gajah Afrika.

Pendahuluan

Di zaman dulu seorang ilmuwan biasa menggunakan ilmu tentang Homolog dan Analog untuk mengetahui sebuah evolusi dari organisme, sekarang ada metode yang lebih akurat untuk membantuk ilmuwan guna memahami proses evolusi yang ada pada organisme yaitu dengan metode Pholygen. Dengan menggunakan analisis Pholygen yang akurat dan baik merupakan dasar yang bagus untuk mengetahui sebuah evolusi. Data yang akurat dan memadai, sangat mendukung manusia untuk mengetahui sebuah hubungan antar organisme, kapan orgnisme itu berevolusi. Dengan mengetahui sebuah evolusi manusia dapat mengetahui perubahan lingkungan yang mendorong proses evolusi. Dengang menjabar lapisan yang terdapat pada genoms mitochondria dapat menjadi sangat berguna untuk menganalisis Phylogenetic Relationships pada sebuah kelompok binatang. Penulis menggunakan metode tesebut untuk mengetahui evolusi gajah

Gajah yang masih hidup dizaman sekarang merupakan sisa dari Elephantidae yang terus bertahan hidup, dimana terdapat dua spesies gajah yang masih bertahan yaitu Gajah Asia dan Gajah Afrika. Untuk mengaetahui evolusi itu diperluhkan sequences of mtDNA dan nuclear DNA (nuDNA) yang berasal dari yang modern maupun yang berasal dari zaman purba. Contoh penggunaannya nuDNA untuk membuktikan bahwa Gajah Hutan Afrika merupakan spesies yang valid dari Loxodonta cyclostis), dan membedakan spesies Gajah Savana Afrika yaitu Loxodonta Africana [7].

Ada dua penelitian tentang mtDNA dari Mammuthus primigenius [3,4] yang membuktikan bahwa Mammoth lebih memiliki kekerabat yang dekat dengan Gajah Asia dibanding dengan Gajah Afrika. Meskipun ada penelitian lain yang menyatakan bahwa beberapa segment dari nuDNA memliki hubungan kekerabatan yang lemah dengan Outgroup, hal itu menjadi masalah dalam analisi Phylogenetic di Elephantidae dan untuk membuktikan hubungan mammoths dan gajah yang sekarang hidup masih belum terpecahkan[8]. Maka dalam penelitian ini akan menggunakna Dogong (Dugong dugon) dan Hyrax (Procovia capensis) sebagai Outgroups. Kedua hewan itu memiliki kekerabatan paling dekat dengan gajah, yang merupakan hasil evolusi dari probosccideans yang terjadi sekita 65 Juta Tahun lalu [5,9], yang memiliki efetifitas sebagai Outgroups untuk menilai gen dari gajah.

Penelitian ini akan menjadi penelitian pertama yang melaporkan studi secar lengkap mengenai mitochondrial genome untuk Mastodon. Sequence itu didapatkan dari sebuah gigi yang berumur Pleitocene yang ditemukan di Utara Alaska[Gambar 1], fosil gigi terfosilkan dengan baik didalam es permanen. Kemudian dilakukan radiocarbon-dated pada collagen yang berasal dari akar gigi memiliki umur 50.000 tahun BP, tetapi secara geologis diperkiran berumur tidak lebih tua dari 150.000 tahun BP.

Gambar 1. Lokasi ditemukannya fosil dari gigi Mastodon yang digunakan sebagai mtDNA( Gambar ini diambil dari Journal: doi:10.137/journal.pbio.0050207.g001)

DISKUSI

Menganalisi Sequnce dan Karakteristiknya

Untuk menentukan Sequence mtDNA dari Mastodon, kami menggunakan 78 pasang, yang dibagi menjadi 2 set yang masing-masing 39 pasang. Setelah diolah dengan metode Obtaining Overlapping DNA from Four Elephantids and A Mastodon[?]

Gambar 2. Proses rekontruksi mtDNA dari gigi mastodon[1](a) mtDNA diekstrak dari gigi menggunakan metode Shutgun 454 Sequencing,kemudian kode-kode yang telah diekstrak diikat(pita hijau dan pita Biru) (b) Bioinformatics analysis of Shotgun 454 sequence,untuk mengidentifikasikan Sequence hasil ektrasi, dilakukan pembandingan dengan Genome dari Loxodanta african (loxAfr 1), genome manusia (hg 18), genome tikus (mm8), database nukleotida dari NCBI’s(env), non-redundant nucleotide database (nr). Didapatkan bahwa hasil ekstrasi lebih mirip dengan DNA yang ada pada Loxodanta Africana sehingga 454 sequence bisa dipasangkan dengan loxAfr 1(motede UCSC Repeat Masker).(c) langkah berikutnya menggandakan hasil dari langkah b dengan metode Multipex PCR , menjadi 213 pasangan primer kemudian dibagi kedalam 5 wadah(tiap wadah 41-44 pasang) yang masing-msing wadah terdapat sampel (La, Loxodanta Africana; Lc, Loxodanta cyclotis; Em 1, Elephas maximus 1, Em 2,  Elephas maximus 2;Mp, Mammuthus primigenius). kemudian dihasilkan 213 hasil yang berbeda tiap samplenya, lalu hasil tersebut dipertimbangankan lagi lalu digabungkan menjadi satu sampe yang akan disimpan dalam database.(Diambil dari Journal no.doi:10.137/journal.pbio.1000564.g001)

Kemudian dihasilkan mtDNA Seguence yang memiliki kemiripan dengan Sequence Elephantidae berada di 71,8-98,6%, kemudian kemiripan Sequence dengan Hyrax dan Dugong antara 45,9-92,6 %, Hasil ini  merupakan hasil yang benar-benar sama dengan Sequence asli dari mastodon.

Mitokondria genom dari mastodon memiliki 13 Protein penkode gen, 22 tRNA gen, 2 rRNA gen dan Control Region. Start kodon pada kode gen untuk ND3, ND4, dan ND6 adalah ATT, ATG, dan GTG. Karena Mastodon berevolusi sekitar 24 juta Tahun lalu, cukup dengan Multipex PCR sudah cukup memadai untuk mendapat sequence pada Mastodon.

Hasil Analisi Phylogenetic

Untuk menganalisi lebih jauh lagi tentang evolusi pada Proboscidean, peneliti menggunakan 6 mt DNA yaitu 2 DNA berasal dari Gajah Afrika, 2 lagi dari Gajah Asia, dan 2 lagi dari Mammuth primigenius, untuk merekontrusi mtDNA pada Mammuth americanum. Mastodon memiliki umur evolusi yang berdekatan dibandingkan dengan Hyrax dan Dugong, Dalam memperkiran suatu hubunga evolusi sangant perlunya Synonimous(d_s) dan Anonsynonimus(dn) Rate. Saat menggunakan Mastodon sebagai outgroup maka didapatkan  Synonimous(d_s) sebanyak 0,4 dan Anonsynonimus(dn) sebanyak 0,05, Namun ketika menggunakan dungong dan hyrax nilai d_s = 1,2 dan d_n= 0,15. Kemudian peneliti juga melakukan perbandingan Transition dan Tranversions Rate pada beberapa spesies lain untuk mengetahui Divergent Event pada Gajah

Gambar 3. Perbandinga Transition dan Transversion. 6 titik diatas menunjukan perbandingan spesies dari Elepantidae, Dugong dan hyrax telah berevolusi dari Proboscidea sejak 65 Juta Tahun lalu[5,9], kemudian 105 juta tahun lalu ada evolusi antara Urantheria-Hewan pemamah biak[9]. Lalu Evolusi anatara mamalia dan burung terjadi 313 Juta Tahun yang lalu[62]

Kelebihan Menggunakan Mastodon sebagai Outgroup

Ada beberapa studi yang telah meneliti tetang evolusi Gajah Asia dan Gajah Afrikan namun tidak menggunakan Mastodon sebagai Outgroup, sehingga studi menggunakan mastodon untuk dapat meningkatakan keakuratan studi. Karena belum ditemukannya fosil gigi mastodon sehingga beberapa ilmuwan lebih menggunkan Dugong dan Hryax. 

Table 1. [4] Rogaev El, Moliaka YK. Malyaruck BA. Kondrashov FA, Derenko MV, et al. 2006. Complate mitokondria Genome and Phylogeny of Pleistocene mammoth Mammuthus primigenius, PLoS Biol 4: e73. Doi:107.1371/journal.pbio.0040073 [3] Krause J. Dear PH, Pollback JL, Slatkin M, Sprigs H, et al. 2006. Multiplex amplification of the mammoths mitochondrial genome dan the evolution of Elepthinidae. Nature 439: 724-727. Kemudian (M-E) menunjukkan kekerabatan untuk Mammoth dan Gajah Asia, (M-L) menunjukkan kekerabatan Mammoth dan Gajah Afrika. Maximum Parsimony merupakan kemampuan gen untuk salin mengkontruksi satu sama lain.ML merupakan metode yang digunakan oleh Rogeav dkk, yang didasari oleh kemungkina pada test ratio  (Sumber doi:10.137/journal.pbio.0050207.t001)

Hasil dari analisis Phylogentic pada Gajah

Untuk menentukan kekerabatan antar spesies diperluhkan perbandingan gen-gen yang ada pada spesies, dengan perbandingan gen-gen tersebut akan lebih mudah untuk memahami hubungan tersebut. Gen-gen dari Mammuthus Elephas, Loxodanta, merupakan sumber gen yang akan dibandingkan, berikut hasil pembandingan gen-gen:

Gambar 4. Topology Gen. Kolom warna menunjukkan kemungkinan adanya hubungan(kekerabatan) antar spesies. Warna Biru menunjukkan kekerabatan Mammuthus – Elephas. Warna Hijau menunjukkan kekerabatan Mammuthus – Loxodanta. Warna Kuning menunjukkan kekerabatan Elephas – Loxodanta. Kolom hitam menunjukkan panjang gen yang didasarkan pada Base Pair (Sumber doi:10.137/journal.pbio.0050207. g003)

Memperkirakan Divergance Event Elephantidea

Sequence pada mtDNA mastodon sangat ideal digunakan untuk memnentukan Divergence event pada Elephantidae, dan juga fosil dari dogong dan hyrax yang merupakan hasil evolusi dari ordo probocideans yang terjadi sekitar 60 Juta Tahun Yang lalu, umur itu diambil dari probocidean paling tua yaitu fosil Phosphaterium.Dan juga menggunakan Posterior Mean dan 95 % Credibility Interval .Karena kedua metode itu dinilai paling akurat karena memiliki Coefficient Coleration 0,85, nilai itu dapat dikembangkan lagi dengan beberapa tambahan informasi.\

Kami juga menggunakan Paleotologically untuk menentukan tahun terjadinya Divergace Event, untuk mastodon terjadi sekitar 24-28 juta tahun yang lalu[10,31] kemudian pada gajah afrika sekitar lebih dari 6 juta tahun yang lalu[32], kemudian untuk Gajah Asia dan mammoth sekitar 6,7 juta tahun yang lalu. Hal itu selaras dengan hasil perhitungan Posterior Mean pada Gajah Afrika terjadi pada 7,6 Juta Tahun lalu, dengan 95% Credibility Interval  pada Gajah afrika terjadi Divergent Event sekitar 6,6 – 8,9 juta tahun yang lalu. Pada Gajah Asia dan Mammoth Divergent Event terjadi pada 6,7 Juta Tahun lalu( Posterior Means), dan 5,8 – 7,7 Juta Tahun Yang lalu. Kedua Divergent Event (Gajah Asia dan Gajah Afrika) selaras dengan ditemukannya fosil gajah afrika yang diperkiran berumur 5,4 -7,3 Juta Tahun Yang Lalu, kemudian fosil Gajah Asia yang dipekirakan berumur 5,2 – 6,7 juta Tahun yang Lalu[33]. Maka didapatkan kejadian yang unik, yaitu terjadi 2 Divergent Event dalam satu juta tahun 

Subtitusi pada mtDNA

Hasil dari sequence mtDNA pada Eleptindae menunjukan bahwa subtitusi melaju lebih rendah dibandingkan dengan spesies lain sperti, manusia, sipanse, baboon, dan gorilla. Penyebab perbedaan ini masih belum diketahui secara pasti, namun penjelasan yang masih mungkin karena adanya perbedaan ukuran tubuh, dan pola metoblisme. Untuk kedepannya studi mengenai hal ini sangat dibutuhkan, karena faktor bisa jadi karena banyak faktor, atau hanya satu faktor dll, yang masih menjadi pertanyaan.

Gambar 5. Hasil penelitian yang berupa diagram Divergent Event

Kesimpulan

Dari sequence mtDNA menunjukkan bahwa Gajah Asia atau Elephas maximus memiliki hubungan kekerabatan dengan mammoth, dan hasil evolusi itu menunjukkan bahwa adanya evolusi yang cepat pada Elephatindea. Namun hubungan spesies Gajah Asia dan Afrika memiliki kekerabatan yang jauh disebabkan proses evolusinya sudah berjalan pada Miosen atas.

Meskipun lingkungan es permanen merupakan lingkungan yang paling ideal untuk DNA dapat bertahan/terawetkan sekitar 130.000tahun, tidak menutup kemungkinan lingkunga es yang bukan permanen juga dapat menyimpan hal yang serupa dengan es permanen. Bahkan DNA pada tumbuhan terawetkan lebih lama lagi yaitu 300.000 – 500.000 tahun.

Daftar Pustaka

[7] Debruyune R (2005) A Case Study of Apparent conflict between molecular phylogenetic. The intterelationship of African elephants. Cladistics 21: 31-50

[5]Shosani J (1998) Understanding probocidean evolution: A formidable task. Trands Ecol 13:480-487

[9]Springer MS. Murphy WJ, Eizirik E, O’Brein SJ (2003) Placental Mammal diversification and The Cretaceous-Tertiarry boundary. Proc Natl Acad Sci USA 100: 1056-1061

[62] Graur D, Martin W (2004) Presicion of Molecular time Estimate. Trends Genet 20: 242-247

[3]Krause J, Dear PH., Pollack JL, Slatkin M, Spriggs H et al. (2006) Multiplex amplification of the mammoth mitochondrial genome and the evolution of Elephantidae. Nature 439: 724-727

[4] Krause J. Dear PH, Pollback JL, Slatkin M, Sprigs H, et al. 2006. Multiplex amplification of the mammoths mitochondrial genome dan the evolution of Elepthinidae. Nature 439: 724-727

[8]Capelli C, Macphee RDE, Roca Al, Brisighell F, Georgiadis N, et al (2006). A Nuclear DNA phylogeny of The Woolly mammoth ( Mammuthus primigenius). Mol Phylogenet Evol 40: 620-627

[10]Shoshani J, Walter RC, Abraha M, Berhe S, Tessy P, et al. (2006) A Proboscidean from The Late Oligoncene of Eritrea, a “missing Link” between early Elephantiformes and Elephantimorpha, and Biogeographic implication. Proc Natl Acad Sci USA 103: 203-217

[31]Shoshani  J, Golenberg EM, Yang H (1998) Elephantidae phylogeny: Morphological versus Molecular results. Acta Theriol Suppl 5: 89-122

[33]Shoshani J, Tassy P. (2005) Advances in Proboscidean Taxonomy & Classification, Anotomy & Phsiology, and Ecology & Behavior. Quaternary Int 126-128: 5-20